深入解析分析方法驗(yàn)證的關(guān)鍵要素與實(shí)操要點(diǎn)！
在藥品研發(fā)、生產(chǎn)與質(zhì)量控制領(lǐng)域，分析方法驗(yàn)證是確保藥品質(zhì)量可靠、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的核心環(huán)節(jié)。下面恒譜生將詳細(xì)探討分析方法驗(yàn)證的定義、法規(guī)要求、應(yīng)用場(chǎng)景、驗(yàn)證流程、關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo)、具體內(nèi)容以及如何制定合理的可接受標(biāo)準(zhǔn)，幫助朋友們?nèi)嬲莆者@一重要概念與實(shí)操要點(diǎn)。
一、分析方法驗(yàn)證的定義與重要性
分析方法驗(yàn)證是指通過(guò)一系列科學(xué)實(shí)驗(yàn)與評(píng)估，證明所建立的分析方法能夠滿足特定檢測(cè)要求的過(guò)程。其目的是確保分析方法在實(shí)際應(yīng)用中能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定藥品的質(zhì)量屬性，如含量、雜質(zhì)、溶出度等。在藥品研發(fā)過(guò)程中，分析方法驗(yàn)證是確定藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵步驟;在生產(chǎn)過(guò)程中，它為藥品的放行提供了科學(xué)依據(jù);在變更管理中，驗(yàn)證則確保變更后的分析方法依然有效。
二、分析方法驗(yàn)證的法規(guī)要求
分析方法驗(yàn)證受到嚴(yán)格的法規(guī)監(jiān)管。中國(guó)GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)明確規(guī)定，檢驗(yàn)方法必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證或確認(rèn)。具體條款如下：
第十二條：質(zhì)量控制的基本要求中指出，檢驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證或確認(rèn)。
第一百四十二條：當(dāng)影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素(如原輔料、包裝材料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)工藝、檢驗(yàn)方法等)發(fā)生變更時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行確認(rèn)或驗(yàn)證。
第二百二十三條：物料和不同生產(chǎn)階段產(chǎn)品的檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：
企業(yè)應(yīng)當(dāng)確保藥品按照注冊(cè)批準(zhǔn)的方法進(jìn)行全項(xiàng)檢驗(yàn)。
符合下列情形之一的，應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證：
采用新的檢驗(yàn)方法;
檢驗(yàn)方法需變更的;
采用《中華人民共和國(guó)藥典》及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗(yàn)方法;
法規(guī)規(guī)定的其他需要驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法。
對(duì)不需要進(jìn)行驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法，企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn)，以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。
第二百三十條：產(chǎn)品的放行應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：
在批準(zhǔn)放行前，應(yīng)當(dāng)對(duì)每批藥品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，保證藥品及其生產(chǎn)符合注冊(cè)和本規(guī)范要求，并確認(rèn)主要生產(chǎn)工藝和檢驗(yàn)方法經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。
這些法規(guī)條款為分析方法驗(yàn)證提供了明確的法律依據(jù)和操作框架，確保藥品質(zhì)量控制的科學(xué)性和規(guī)范性。
三、什么時(shí)候需要進(jìn)行分析方法驗(yàn)證
分析方法驗(yàn)證并非在所有情況下都需要進(jìn)行，而是根據(jù)具體的應(yīng)用場(chǎng)景和法規(guī)要求來(lái)決定。以下是一些常見(jiàn)的需要進(jìn)行分析方法驗(yàn)證的情況：
（一）建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)：在藥品研發(fā)階段，當(dāng)確定藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要對(duì)用于檢測(cè)藥品質(zhì)量的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保這些方法能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定藥品的質(zhì)量屬性。
（二）變更藥品生產(chǎn)工藝或制劑組分時(shí)：如果藥品的生產(chǎn)工藝或制劑組分發(fā)生了變更，可能會(huì)對(duì)藥品的質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此需要重新驗(yàn)證分析方法，以確保變更后的分析方法依然能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)藥品的質(zhì)量。
（三）修訂原分析方法時(shí)：當(dāng)對(duì)原有的分析方法進(jìn)行修訂或改進(jìn)時(shí)，需要對(duì)修訂后的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，以證明其有效性和可靠性。
（四）采用新的檢驗(yàn)方法時(shí)：如果企業(yè)采用了一種新的檢驗(yàn)方法，需要對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保其能夠滿足藥品質(zhì)量控制的要求。
（五）法規(guī)要求時(shí)：在某些情況下，法規(guī)可能會(huì)要求對(duì)特定的檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保藥品的質(zhì)量符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
四、分析方法驗(yàn)證的流程
分析方法驗(yàn)證的流程是一個(gè)系統(tǒng)化的過(guò)程，主要包括以下幾個(gè)步驟：
驗(yàn)證方案的制定：在驗(yàn)證開(kāi)始之前，需要制定詳細(xì)的驗(yàn)證方案。驗(yàn)證方案應(yīng)包括驗(yàn)證的目的、范圍、驗(yàn)證指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)處理和可接受標(biāo)準(zhǔn)等內(nèi)容。驗(yàn)證方案的制定應(yīng)基于對(duì)藥品特性和分析方法的深入了解，確保驗(yàn)證過(guò)程的科學(xué)性和合理性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品準(zhǔn)備：根據(jù)驗(yàn)證方案，設(shè)計(jì)具體的實(shí)驗(yàn)步驟和樣品制備方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)考慮各種可能影響分析結(jié)果的因素，如樣品的濃度范圍、實(shí)驗(yàn)條件的變化等。樣品的準(zhǔn)備應(yīng)確保樣品的代表性和均勻性，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
實(shí)驗(yàn)操作與數(shù)據(jù)記錄：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各種數(shù)據(jù)和觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)，確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。數(shù)據(jù)記錄應(yīng)準(zhǔn)確、完整，以便于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和評(píng)估。
數(shù)據(jù)分析與評(píng)估：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)估分析方法的各項(xiàng)驗(yàn)證指標(biāo)是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)分析應(yīng)采用科學(xué)的統(tǒng)計(jì)方法，如計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)系數(shù)等，以客觀地評(píng)價(jià)分析方法的性能。評(píng)估結(jié)果應(yīng)詳細(xì)記錄在驗(yàn)證報(bào)告中，為最終的驗(yàn)證結(jié)論提供依據(jù)。
驗(yàn)證報(bào)告的撰寫：驗(yàn)證報(bào)告是對(duì)整個(gè)驗(yàn)證過(guò)程和結(jié)果的總結(jié)，應(yīng)包括驗(yàn)證方案、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析和評(píng)估等內(nèi)容。驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)詳細(xì)、清晰，能夠全面反映驗(yàn)證過(guò)程的科學(xué)性和驗(yàn)證結(jié)果的有效性。驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)經(jīng)過(guò)審核和批準(zhǔn)，作為分析方法驗(yàn)證的最終文件記錄。
五、驗(yàn)證的分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)
在分析方法驗(yàn)證中，需要對(duì)多個(gè)分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，以全面評(píng)價(jià)分析方法的性能。以下是一些常見(jiàn)的分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)：
(一)分析項(xiàng)目
含量測(cè)定：用于測(cè)定藥品中有效成分的含量，是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一。含量測(cè)定方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定藥品的含量，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。
雜質(zhì)檢查：用于檢測(cè)藥品中雜質(zhì)的種類和含量，包括有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑等。雜質(zhì)檢查方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其能夠靈敏、專一地檢測(cè)出藥品中的雜質(zhì)，為藥品的安全性提供保障。
溶出度測(cè)定：對(duì)于固體制劑，溶出度測(cè)定是評(píng)估藥品在體外釋放藥物的能力的重要指標(biāo)。溶出度測(cè)定方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其能夠模擬體內(nèi)藥物釋放的過(guò)程，為藥品的療效提供參考。
鑒別反應(yīng)：用于確認(rèn)藥品的真?zhèn)?，通過(guò)特定的化學(xué)反應(yīng)或物理性質(zhì)來(lái)區(qū)分藥品與其他物質(zhì)。鑒別反應(yīng)方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其具有良好的專屬性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確地鑒別藥品。
其他相關(guān)項(xiàng)目：根據(jù)藥品的特性和質(zhì)量控制的要求，還可能需要對(duì)其他相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行驗(yàn)證，如pH值測(cè)定、水分含量測(cè)定、粒度分布測(cè)定等。
(二)驗(yàn)證指標(biāo)
專屬性：指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的能力。專屬性是分析方法驗(yàn)證的重要指標(biāo)之一，對(duì)于含量測(cè)定、雜質(zhì)檢查和鑒別反應(yīng)等分析項(xiàng)目尤為重要。驗(yàn)證專屬性時(shí)，應(yīng)考察分析方法在不同條件下的分離能力和干擾情況，確保分析方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)成分。
準(zhǔn)確度：指用所建立的分析方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，通常用回收率(%)表示。準(zhǔn)確度的驗(yàn)證應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)進(jìn)行，通過(guò)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤M(jìn)行比較，評(píng)估分析方法的準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確度的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法能夠提供可靠的檢測(cè)結(jié)果。
精密度：指在規(guī)定的測(cè)定條件下，同一份均勻供試品經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。精密度的驗(yàn)證包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性三個(gè)方面。重復(fù)性是指在短時(shí)間內(nèi)由同一個(gè)分析人員對(duì)同一份樣品進(jìn)行多次測(cè)定的精密度;中間精密度是指在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的條件改變(如不同時(shí)間、不同分析人員、不同設(shè)備等)時(shí)測(cè)定結(jié)果的精密度;重現(xiàn)性是指不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的精密度。精密度的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法的可靠性和可重復(fù)性。
檢測(cè)限：指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限是雜質(zhì)檢查和限度試驗(yàn)的重要指標(biāo)，用于確定分析方法能夠檢測(cè)到的最低濃度或含量。檢測(cè)限的驗(yàn)證通常采用直觀法、信噪比法或基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法等方法進(jìn)行。驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法能夠靈敏地檢測(cè)出藥品中的雜質(zhì)或微量成分。
定量限：指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。定量限的驗(yàn)證方法與檢測(cè)限類似，但要求更高，需要同時(shí)滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求。定量限的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法能夠準(zhǔn)確地定量測(cè)定藥品中的微量成分。
線性：指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，線性試驗(yàn)結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈比例關(guān)系的能力。線性是含量測(cè)定和雜質(zhì)檢查等分析項(xiàng)目的重要指標(biāo)，用于評(píng)估分析方法在不同濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。線性的驗(yàn)證應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)進(jìn)行，通過(guò)制備一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，測(cè)定其響應(yīng)信號(hào)，并用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。線性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
范圍：指分析方法能達(dá)到精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍的驗(yàn)證應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。例如，原料藥和制劑含量測(cè)定的范圍一般為測(cè)定濃度的80%～120%;制劑含量均勻度檢查的范圍一般為測(cè)定濃度的70%～130%;雜質(zhì)測(cè)定的范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。范圍的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定藥品的質(zhì)量屬性。
耐用性：指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。耐用性是分析方法驗(yàn)證的重要指標(biāo)之一，用于評(píng)估分析方法在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定性和可靠性。耐用性的驗(yàn)證應(yīng)考慮各種可能影響分析結(jié)果的因素，如被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間、流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。通過(guò)在這些條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，評(píng)估分析方法的耐用性。耐用性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在常規(guī)檢驗(yàn)中能夠穩(wěn)定地提供可靠的檢測(cè)結(jié)果。
六、分析方法驗(yàn)證的具體內(nèi)容
(一)專屬性
專屬性是分析方法驗(yàn)證的重要內(nèi)容之一，它確保在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物。以下是專屬性驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
鑒別反應(yīng)：鑒別反應(yīng)應(yīng)能夠區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似的化合物。在驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)使用不含被測(cè)成分的供試品以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保這些物質(zhì)在鑒別反應(yīng)中均呈陰性反應(yīng)，而被測(cè)成分則呈陽(yáng)性反應(yīng)。
含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定：對(duì)于含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定，采用的色譜法和其他分離方法應(yīng)附代表性圖譜，以說(shuō)明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置。色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分離。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸(堿)水解或氧化的方法進(jìn)行強(qiáng)制破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響。含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢査應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光電二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行峰純度檢查。
(二)準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度是評(píng)估分析方法測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近程度的重要指標(biāo)，通常用回收率(%)表示。以下是準(zhǔn)確度驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
化學(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度：原料藥可用已知純度的對(duì)照品或供試品進(jìn)行測(cè)定，或用所測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。
化學(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度：可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到雜質(zhì)對(duì)照品，可用所建立的方法與另一成熟方法(如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。
中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度：可用已知純度的對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定，即向已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi);加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過(guò)小則引起較大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。
數(shù)據(jù)要求：對(duì)于化學(xué)藥應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率(%)，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間(置信度一般為95%);對(duì)于中藥應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率(%)計(jì)算值，以及回收率(%)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度關(guān)系可參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和指南。
(三)精密度
精密度是評(píng)估分析方法在規(guī)定條件下測(cè)定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性的關(guān)鍵指標(biāo)，通常用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。以下是精密度驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
重復(fù)性：在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度(分析方法擬定的樣品測(cè)定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平)的供試品，用至少6份的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià);或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用至少9份測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。
中間精密度：考察隨機(jī)變動(dòng)因素，如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響，應(yīng)進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。
重現(xiàn)性：國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)室協(xié)同檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過(guò)程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)所用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對(duì)該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果。
數(shù)據(jù)要求：均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和指南。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度限度可適當(dāng)放寬。
(四)檢測(cè)限
檢測(cè)限是評(píng)估分析方法能夠檢測(cè)出的最低量的重要指標(biāo)，它僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒(méi)有定量意義。以下是檢測(cè)限驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
直觀法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。
信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。
基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法：按照LOD=3.3δ/S公式計(jì)算。式中LOD：檢測(cè)限;δ：響應(yīng)值的偏差;S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可以通過(guò)下列方法測(cè)得：測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
數(shù)據(jù)要求：上述計(jì)算方法獲得的檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。
(五)定量限
定量限是評(píng)估分析方法能夠定量測(cè)定的最低量的重要指標(biāo)，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。以下是定量限驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
直觀法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地定量測(cè)定的最低濃度或量。
信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地定量的被測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。
基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法：按照LOQ=10δ/S公式計(jì)算。式中LOQ：定量限;δ：響應(yīng)值的偏差;S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可以通過(guò)下列方法測(cè)得：測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
數(shù)據(jù)要求：上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。
(六)線性
線性是評(píng)估分析方法在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)線性關(guān)系的重要指標(biāo)，它確保在不同濃度下測(cè)定結(jié)果與被測(cè)物濃度呈比例關(guān)系。以下是線性驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
線性試驗(yàn)設(shè)計(jì)：應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎猛粚?duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)不同濃度水平。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，或者可采用描述濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。
數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、殘差平方和、線性圖(或其他數(shù)學(xué)模型)。線性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
(七)范圍
范圍是評(píng)估分析方法在精密度、準(zhǔn)確度和線性要求下能夠測(cè)定的高低限濃度或量的區(qū)間。以下是范圍驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
范圍確定：范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。例如，原料藥和制劑含量測(cè)定的范圍一般為測(cè)定濃度的80%～120%;制劑含量均勻度檢查的范圍一般為測(cè)定濃度的70%～130%;溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定的范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%;雜質(zhì)測(cè)定的范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定和純度檢查，且僅使用100%的對(duì)照品，線性范圍應(yīng)覆蓋雜質(zhì)的報(bào)告水平至規(guī)定含量的120%。在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。
數(shù)據(jù)要求：范圍驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定藥品的質(zhì)量屬性。
(八)耐用性
耐用性是評(píng)估分析方法在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度的重要指標(biāo)。以下是耐用性驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
耐用性評(píng)估：耐用性驗(yàn)證應(yīng)考慮各種可能影響分析結(jié)果的因素，如被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間、流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。通過(guò)在這些條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，評(píng)估分析方法的耐用性。
數(shù)據(jù)要求：耐用性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在常規(guī)檢驗(yàn)中能夠穩(wěn)定地提供可靠的檢測(cè)結(jié)果。
七、如何制定方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)
制定方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)是分析方法驗(yàn)證的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，它為驗(yàn)證結(jié)果的評(píng)估提供了明確的依據(jù)。以下是制定可接受標(biāo)準(zhǔn)的具體方法：
參考藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定各項(xiàng)指標(biāo)的可接受范圍。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制的基本依據(jù)，因此在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)首先參考藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的要求。
結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)、加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和影響因素試驗(yàn)的結(jié)果，評(píng)估藥品在不同條件下的穩(wěn)定性變化規(guī)律，確定合理的可接受標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)能夠反映分析方法在實(shí)際應(yīng)用中的性能，因此在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)充分考慮試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和合理性。
考慮藥品用途和風(fēng)險(xiǎn)：對(duì)于一些高風(fēng)險(xiǎn)藥品或特殊用途藥品，可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)更為嚴(yán)格。藥品的用途和風(fēng)險(xiǎn)不同，對(duì)藥品質(zhì)量的要求也不同。因此，在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥品的用途和風(fēng)險(xiǎn)，制定相應(yīng)的可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保藥品的安全性和有效性。
參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)和指南：參考中國(guó)GMP、ICH等法規(guī)和指南中對(duì)藥品穩(wěn)定性研究的要求，制定符合規(guī)定的可接受標(biāo)準(zhǔn)。法規(guī)和指南為藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了明確的指導(dǎo)，因此在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)參考相關(guān)的法規(guī)和指南，確保可接受標(biāo)準(zhǔn)的合法性和科學(xué)性。
八、案例分析
為了更好地理解分析方法驗(yàn)證的流程和要點(diǎn)，以下是一個(gè)具體的案例分析：
案例背景
某制藥企業(yè)開(kāi)發(fā)了一種新的化學(xué)藥品，需要對(duì)其含量測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證。該藥品的主要成分是化合物A，含量測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC)。
驗(yàn)證方案
驗(yàn)證目的：驗(yàn)證HPLC方法能否準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定化合物A的含量。
驗(yàn)證范圍：含量測(cè)定范圍為化合物A濃度的80%～120%。
驗(yàn)證指標(biāo)：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、范圍和耐用性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用已知純度的化合物A對(duì)照品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制備一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。
數(shù)據(jù)處理：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)。
可接受標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)，制定各項(xiàng)指標(biāo)的可接受標(biāo)準(zhǔn)。
驗(yàn)證過(guò)程
專屬性驗(yàn)證：通過(guò)HPLC圖譜分析，確認(rèn)在其他成分(如雜質(zhì)、輔料等)存在的情況下，化合物A的色譜峰能夠清晰分離，無(wú)干擾。
準(zhǔn)確度驗(yàn)證：在化合物A濃度的80%、100%和120%三個(gè)水平下，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算回收率，結(jié)果均在98%～102%之間，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
精密度驗(yàn)證：
重復(fù)性：在同一濃度(100%)下，制備6份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果為1.2%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
中間精密度：在不同日期、不同分析人員、不同儀器條件下，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算RSD，結(jié)果為1.5%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
重現(xiàn)性：在不同實(shí)驗(yàn)室條件下，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算RSD，結(jié)果為1.8%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
線性驗(yàn)證：制備5個(gè)不同濃度的化合物A對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R2)，結(jié)果為0.999.符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
范圍驗(yàn)證：在化合物A濃度的80%～120%范圍內(nèi)，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。評(píng)估線性、準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
耐用性驗(yàn)證：在流動(dòng)相組成、pH值、柱溫等條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。評(píng)估分析結(jié)果，結(jié)果均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
驗(yàn)證結(jié)論
通過(guò)上述驗(yàn)證過(guò)程，HPLC方法在專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、范圍和耐用性等方面均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定化合物A的含量。因此，該HPLC方法可用于該藥品的含量測(cè)定。
九、總結(jié)
分析方法驗(yàn)證是藥品研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它確保分析方法能夠準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定藥品的質(zhì)量屬性。通過(guò)了解分析方法驗(yàn)證的定義、法規(guī)要求、應(yīng)用場(chǎng)景、驗(yàn)證流程、關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo)、具體內(nèi)容以及如何制定合理的可接受標(biāo)準(zhǔn)，可以更好地開(kāi)展分析方法驗(yàn)證工作，為藥品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在實(shí)際操作中，應(yīng)根據(jù)藥品的特性和質(zhì)量控制要求，制定詳細(xì)的驗(yàn)證方案，嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，確保驗(yàn)證結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。同時(shí)，應(yīng)參考相關(guān)的法規(guī)和指南，確保驗(yàn)證工作的合法性和規(guī)范性。
發(fā)布于: 2025-08-22